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自2019年底新冠疫情暴發(fā)，核酸檢測對患者診斷和疾控管理發(fā)揮了重要作用。然而實(shí)際檢測中，卻經(jīng)常有假陰性的情況發(fā)生。假陰性可能會(huì)導(dǎo)致病毒攜帶者被漏診，尚無康復(fù)的患者誤出院，以及輸血中的一些潛在安全問題。

那么假陰性的原因有哪些？來自中國的研究發(fā)現(xiàn)，對檢測樣本的熱滅活，可能是假陰性的一大原因。當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月15日，美國臨床化學(xué)協(xié)會(huì)與牛津大學(xué)出版社合作出版的國際領(lǐng)先的臨床實(shí)驗(yàn)室科學(xué)期刊Clinical Chemistry刊發(fā)了來自北京疾病預(yù)防控制中心、北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心、首都醫(yī)科大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院和北京醫(yī)院的論文“Potential False-Negative Nucleic Acid Testing Results for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Thermal Inactivation of Samples with Low Viral Loads”。

論文稱：為了安全，國家衛(wèi)健委相關(guān)指南要求在提取樣本核酸前需將樣本置于56℃以上以滅活病毒。但是，熱滅活本身可能會(huì)破壞作為單鏈RNA的新冠病毒的核酸完整性，并在RT-PCR測試中出現(xiàn)假陰性。

這項(xiàng)研究的通訊作者為北京市疾控中心傳染病地方病控制所所長、研究員王全意和來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院的任思楣。

研究團(tuán)隊(duì)調(diào)查了熱滅活是否會(huì)影響病毒核酸檢測的結(jié)果。研究者檢查了熱滅活對SARS-CoV-2定量RT-PCR結(jié)果的影響，特別是對于攜帶低病毒載量的標(biāo)本的假陰性結(jié)果的比率。研究者還探討了不同樣品類型，樣品保存時(shí)間和化學(xué)滅活方法對核酸檢測的影響。

目前，中國已有100多家企業(yè)開發(fā)了用于新冠核酸檢測的試劑盒，其中9個(gè)已獲得國家藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)。經(jīng)過國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑盒，在臨床試驗(yàn)中對確診病例的樣品均顯示出90％以上的高靈敏度。但是，在實(shí)際的臨床環(huán)境中，疑似患者的陽性診斷率沒有評估的那么高。許多疑似患者表現(xiàn)出與肺炎一致的典型臨床癥狀或影像學(xué)研究，但在RT-PCR測試中未發(fā)現(xiàn)陽性。這就提出了一個(gè)問題，是什么導(dǎo)致這些臨床上的假陰性？

國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的試劑盒通常來說質(zhì)量都是非常高的，而操作者也不太可能因?yàn)楹怂崽崛『蜋z測程序不當(dāng)產(chǎn)生大量假陰性。那么，臨床上收集的樣品類型（比如，是熱滅活還是化學(xué)滅活）可能是導(dǎo)致RT-PCR測試性能低于預(yù)期的主要原因之一。

考慮到SARS-CoV-2是單鏈RNA病毒，分離其基因組需要謹(jǐn)慎處理樣品，并保持良好的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范。SARS-CoV-2具有很強(qiáng)的傳染性，許多實(shí)驗(yàn)室在提取RNA之前，已對樣本進(jìn)行56-60°C滅活30-60分鐘，以保證操作人員的安全。盡管學(xué)術(shù)界懷疑這種預(yù)處理可能會(huì)影響低病毒載量樣品中SARS-CoV-2的檢測，但對其影響的定量分析仍然不足。此次研究中，研究者調(diào)查了熱滅活對SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果的定量影響，并評估了由于熱滅活引起的假陰性率。研究者進(jìn)一步研究了不同樣品類型，樣品保存時(shí)間和化學(xué)滅活方法對核酸檢測的影響。

該研究顯示，從確診的COVID-19患者的標(biāo)本經(jīng)過熱孵育后，在RT-PCR測試時(shí)Ct值較熱滅活前的樣板升高（編注：Ct值與病毒載量成反比，Ct值升高，意味著測試出的病毒載量偏低）。此外，在至少一項(xiàng)平行測試中，加熱滅活后的的弱陽性樣品中約一半（15個(gè)樣品中的7個(gè)，占46.7％）成為RT-PCR陰性。研究者發(fā)現(xiàn)，與熱滅活相比，使用胍鹽裂解法保存這些樣品對RT-PCR結(jié)果的影響較小，假陰性更少（15個(gè)樣品中的2個(gè)，占13.3％），Ct值的增加也明顯更少。

本研究采用的樣本來自北京23名已確診的新冠患者。研究收集了19個(gè)咽拭子，2個(gè)痰樣本和2個(gè)糞便樣本。將4支咽拭子和痰標(biāo)本保存在3 μmL標(biāo)準(zhǔn)病毒運(yùn)輸液（VTM）中。其他15支弱陽性喉拭子保存在3 μmL標(biāo)準(zhǔn)病毒運(yùn)輸液或者3 μmL的化學(xué)滅活的緩沖液中。糞便樣本保存在采樣管中。所有樣品都保持在4°C并在4小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。

研究發(fā)現(xiàn)熱滅活可以導(dǎo)致RT-PCR檢測中病毒核酸的可檢測量減少和Ct值增加（Ct值與病毒載量成反比），這一結(jié)果與最近的豬流行性腹瀉病毒模型的研究結(jié)果一致。熱滅活對攜帶高病毒載量的標(biāo)本的定性結(jié)果沒有顯著影響。但是，對于弱陽性樣本（Ct值范圍為33.37至36.89），熱滅活可能是實(shí)驗(yàn)室檢測SARS-CoV-2時(shí)假陰性結(jié)果的可能原因之一。

據(jù)推測，熱失活可能會(huì)對早期感染患者的檢測產(chǎn)生潛在影響，導(dǎo)致核酸檢測無法在患者病毒載量尚低時(shí)就檢測出來。在研究中，近一半的弱陽性樣本（15個(gè)樣本中的7個(gè)，占46.7％）顯示假陰性結(jié)果。這7個(gè)樣本的平均Ct值（36.25）相當(dāng)于約700拷貝/ mL，這也可能是熱敏感的可能閾值。

因此，研究者呼吁，迫切需要提高實(shí)驗(yàn)室檢測的準(zhǔn)確率。采用化學(xué)滅活劑，例如胍鹽類的RNA樣本保存制劑，可以視為避免生物安全風(fēng)險(xiǎn)的替代方法。研究結(jié)果表明，與低病毒載量樣品中的熱滅活相比，這些滅活劑可能有更好的測定性能和檢測率。但是，化學(xué)滅活劑的狹窄適用性，有限的可獲得性和潛在的環(huán)境污染，限制了它們在SARS-CoV-2測試中的應(yīng)用。

附：實(shí)驗(yàn)結(jié)果